共創(chuàng)共贏
一、液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前，進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是*條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1.樣品前處理
a、使用流動相溶解樣品。
b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。
c、使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
2.流動相的配置
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。
b、流動相與樣品不產生化學反應
c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
當選用*流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
a．流動相要求使用0.45µm濾膜過濾，除去微粒雜質。
b．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
4.流動相平衡：
a、在進行樣品檢測前，至少使用20倍柱體積流動相使色譜柱充分平衡。流動相一定要使用色譜級別的溶劑。如使用水相的緩沖液應當天配制以保持新鮮避免細菌產生。
b、流動相使用前需用微孔濾膜過濾,消除流動相中顆粒對色譜系統和色譜柱的損壞。緩沖液與其他流動相混合后應重新過濾避免溶解度變化造成產生新的沉淀。不應使用純水作為流動相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞（添加5％的有機溶劑沖洗色譜柱，同時可以達到對緩沖鹽清洗的作用。還可以使色譜柱更容易平衡）。
c、流動相需脫氣后使用，可避免因氣泡導致的泵和檢測器的工作不正常。如果測試時使用的流動相與色譜柱保存使用的流動相有較大區(qū)別，應該使用過度分布的形式進行平衡。避免由于流動相的突然變化造成柱壓增加過大或流動相緩沖鹽結晶造成對色譜柱和儀器系統的損壞。正相色譜柱比反相色譜柱需要更長的平衡時間。
5.色譜柱的使用
（1）柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產生空隙。
（2）如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
（3）避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。
（4）應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧４蠖鄶捣聪嗌V柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
（5）如使用柱溫控制裝置時，應注意在通人流動相后才能升溫。
（6）一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
（7）選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
（8）避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
（9）經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。
（10）保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置超過晚上12點或更長時間。
（11）色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進人柱內，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
（12）在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時對色譜分析系統進行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內的雜質。
（13）如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡；分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。
二、液相色譜柱的管理
制定色譜柱管理的標準操作規(guī)程并嚴格執(zhí)行。每一根新購進的色譜柱必須造冊登記,內容包括:生產公司、品名、型號、規(guī)格、購進時間、啟用時間、單價、柱內保護溶液等。色譜柱分類存放,硅膠柱、化學鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱各用一個色譜柱盒,盒上貼上標簽,注明類別。隨柱說明書裝入密實袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱,在色譜柱上貼上標簽,注明啟用日期。每根柱子每兩個月保養(yǎng)一次,特別是對于一些使用頻率少的柱子,因為放置時間長,容易干柱,每一次做好保養(yǎng)記錄。對于確已失效的柱子,做好停用記錄,不能隨意丟棄,專門存放,如果現用的柱子的填料需要填補,可以用存放的柱子的填料。在從事生產的單位的質檢部門,對于使用時間較長柱效降低的柱子,可把它用于檢測產品的中間體。
三、液相色譜柱的保養(yǎng)和再生清洗
色譜柱使用一段時間后,常遇到柱子被污染,柱效會有一定程度的下降,采用適當的方法對色譜柱進行保護,可以延長色譜柱的使用壽命。
保護柱（預柱）的使用:對于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一保護柱,防止樣品中雜質污染分析柱,對于制備柱,因其進樣量大,使用保護柱尤為重要。
再生處理包括正反兩種順序：
硅膠柱（未鍵合）：正己烷←→二氯甲烷←→異丙醇
硅膠基質非極性鍵合相（C18,C8,C4,C2,C1,PHENYL,CN,NH2）：95%水/5%乙腈（甲醇）←→乙腈（甲醇）←→THF；（含蛋白污染物）B從10％到90％的梯度，A=0.1％TFA水溶液，B=0.1％TFA乙腈溶液
硅膠基質極性鍵合相（CN，NH2，DIOL等）：氯仿←→異丙醇←→二氯甲烷←→庚烷
離子交換樹脂柱（SCX/SAX等）：一般采用高濃度（1-2molL）的NaCl溶液
油脂等物質可用低濃度堿溶液（如0.1molL的NaOH溶液）沖洗
酸性有機物用低pH緩沖液沖洗
堿性有機物用高pH緩沖液沖洗,再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷沖洗。
凝膠色譜柱（GPC/GFC等）：通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑沖洗
疏水蛋白可用24%或30%乙腈沖洗超過晚上12點除去
親水蛋白可用30%-50%乙酸除去
痕量胃蛋白酶可用蛋白水解酶處理分解,再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
建議清洗柱子的其他條件：
溶劑體積：推薦使用柱體積的10-20倍
流速：推薦使用常規(guī)流速的1/5-1/2
不同流動相轉換：推薦換相時濃度梯度由小到大
